В 2018 — 2020 годах Лабораторией выполнен проект «Разработка технологии создания биомедицинского клеточного продукта для лечения обморожений, ожогов и ранений в условиях Арктики» (уникальный идентификатор проекта RFMEFI57518X0179) в соответствии с Соглашением с Минобрнауки России о предоставлении из федерального бюджета субсидии № 14.575.21.0179 от 28.11.2018 в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014−2020 годы».
На этапе № 1 в период с 31.05.2018 г. по 31.12.2018 г. выполнены следующие работы:
- подготовлен Аналитический обзор современной научно-технической и нормативной литературы по исследуемой тематике, а также проведены патентные исследования;
- разработана методика забора биоматериала, культивирования мезенхимальных стволовых клеток животных в среде с пониженным содержанием кислорода и их криоконсервации.
На основании проанализированной литературы доказано, что регенераторный потенциал стволовых клеток определяется прежде всего тем спектром паракринных факторов, которые секретируются клеткой в процессе жизнедеятельности. Доказано, что на качественные и количественные характеристики секретируемых паракринных факторов оказывает решающее влияние то микроокружение, в котором клетка культивируется. Одним из наиболее значимых показателей микроокружения стволовых клеток является концентрация кислорода.
В результате разработки методики была подобрана оптимальная температура, концентрация газов и влажность для культивирования клеток в мультигазовом СО2-инкубаторе (t = 37 С, атмосфера с 5% СО2, 5% О2, 90% N2 и 95% влажность).
Комиссия Минобрнауки России признала обязательства по Соглашению на отчетном этапе исполненными надлежащим образом.
На этапе № 2 в период с 01.01.2019 г. по 31.12.2019 г. выполнены следующие работы:
- получены первичные линии мезенхимальных стволовых клеток животных, а также проведен анализ их фенотипического профиля, пролиферативной и секреторной активности;
- изучено влияние среды с пониженной концентрацией кислорода на жизнеспособность и секреторную активность мезенхимальных стволовых клеток животных;
- разработан Протокол доклинических исследований эффективности и безопасности мезенхимальных стволовых клеток животных в условиях гипоксии;
- наработаны экспериментальные образцы мезенхимальных стволовых клеток животных, проведен анализ их фенотипического профиля, пролиферативной и секреторной активности;
- изучена фенотипическая стабильность мезенхимальных стволовых клеток животных после криоконсервации.
На основании фенотипического анализа полученные первичные линии МСК характеризуются высокой чистотой и однородностью. Экспериментальные образцы МСК мыши и крысы соответствуют требованиям, предъявляемым к фенотипу МСК, и сохраняют способность к дифференцировке в адипогенном, остеогенном и хондрогенном направлениях. Исследование фенотипического профиля МСК мыши после криоконсервации показало, что цикл «заморозки-разморозки» не оказывает влияния на стабильность фенотипа.
Изучено влияние среды с пониженной концентрацией кислорода на выживаемость и секрецию ростовых факторов и цитокинов МСК животными. В условиях гипоксии (в атмосфере с 5%-ным содержанием кислорода) колонии крысиных и мышиных МСК демонстрируют ускоренный рост по сравнению с колониями, выращенными при содержании 21% кислорода в атмосфере. Установлено, что МСК демонстрируют увеличение секреции ростовых факторов bFGF, VEGF, HGF и др. активных биомолекул в условиях гипоксии по сравнению с МСК, выращиваемыми в нормоксии.
Результаты проведенных исследований были опубликованы в научных журналах и представлены на конференциях.
Соисполнителями проекта в рамках этапа № 2 выполнены следующие работы:
- изучена жизнеспособность экспериментальных образцов мезенхимальных стволовых клеток животных, культивированных в среде с пониженной концентрацией кислорода, после трансплантации в ткани экспериментальных животных;
- проведены доклинические исследования по оценке безопасности мезенхимальных стволовых клеток животных (острая и хроническая токсичность) в условиях гипоксии.
Установлено, что МСК, культивированные в условиях пониженного содержания кислорода (5%), сохраняют свою жизнеспособность после трансплантации в ткани животного в течение 9 суток. МСК, культивированные в условиях нормального содержания кислорода (21%), сохраняют свою жизнеспособность менее 6 суток.
По результатам проведенных исследований не установлено существенных признаков повреждающего действия суспензии МСК костного мозга крысы на организм крыс при однократном и многократном внутримышечном введении. Также не установлено существенных признаков повреждающего действия суспензии МСК костного мозга мыши при однократном внутримышечном введении беспородным мышам. У обоих исследованных препаратов отсутствует местное раздражающее действие.
По результатам выполнения второго этапа работ была разработана модель местного отморожения тканей, соответствующая III-IV степени по тяжести повреждения. Получен патент на изобретение № 2 703 473 «Способ моделирования отморожения кожных покровов в гипоксических условиях».
Комиссия Минобрнауки России признала обязательства по Соглашению на отчетном этапе исполненными надлежащим образом.
На этапе № 3 в период с 01.01.2020 г. по 30.09.2020 г. выполнены следующие работы:
- получены первичные линии мезенхимальных стволовых клеток человека (работы выполнены Соисполнителем);
- изучено влияние среды с пониженной концентрацией кислорода на жизнеспособность и секреторную активность мезенхимальных стволовых клеток человека;
- наработаны образцы биомедицинского клеточного продукта на основе мезенхимальных стволовых клеток человека, проведен анализ их фенотипического профиля, пролиферативной и секреторной активности;
- изучена фенотипическая стабильность мезенхимальных стволовых клеток человека после криоконсервации.
Биомедицинский клеточный продукт соответствует требованиям, предъявляемым к фенотипу МСК, и сохраняют способность к дифференцировке в адипогенном, остеогенном и хондрогенном направлениях. Исследование фенотипического профиля после криоконсервации показало, что цикл «заморозки-разморозки» не оказывает влияния на стабильность фенотипа.
Результаты проведенных исследований были опубликованы в
научных журналах и представлены на
конференциях.
Соисполнителями проекта в рамках этапа № 3 выполнены следующие работы:
- проведены доклинические исследования по оценке эффективности мезенхимальных стволовых клеток животных на моделях местного обморожения, механической травмы и химического ожога в условиях гипоксии и гипотермии.